电针改善不同年龄段大鼠创伤应激致免疫抑制的酪氨酸蛋白激酶Fyn机制

【摘要】应激或应激反应是指机体在受到各种强烈因素(应激源)刺激时所出现的非特异性全身反应。应激作为一种强烈刺激能通过影响下丘脑—垂体—肾上腺轴(HPA轴)及交感神经系统的活动,从而改变机体的免疫状态。下丘脑—垂体—肾上腺轴及交感神经系统主要通过神经递质、激素、细胞因子等介导到免疫系统的调节中,例如糖皮质激素、肾上腺素、去甲肾上腺素、胰高血糖素、白介素-1、内啡肽等,它们通过作用于免疫细胞上相应的受体对其功能起到不同的调节作用。应激通过“神经—内分泌—免疫”网络,给机体各系统的功能带来一系列改变。在中枢神经系统,前额皮层、海马、下丘脑已被证实是与应激密切相关的脑区,参与到应激过程中对免疫系统的调节。外科手术作为一种临床常见的诊疗手段,也作为一个应激源,在治疗的同时也影响了免疫系统的功能。临床上发现重大外科手术产生的应激可引起机体免疫功能受抑制。动物实验中的创伤应激也成功诱导了大鼠的免疫抑制。另外,临床上中老年人在面对手术带来的创伤时,免疫功能所受到的影响更为明显,恢复时间延长,并发感染的机会明显提高,严重时甚至威胁生命。如何提高机体的免疫功能、尤其是找寻加快中老年人术后恢复的手段,对于更好的开展临床疾病手术治疗具有重要的意义。针刺治疗作为我国传统医学的一个重要分支,具有悠久的历史,并且具有安全、有效、简便、副作用极少的优点。电针对免疫系统的调节已经受到越来越多的关注,针灸调节免疫的关键是“扶正固本”,其调节作用已经得到了很多临床试验的验证。针刺对免疫系统的调节作用包括对淋巴细胞、外周血白细胞、单核巨噬细胞、NK细胞的数量、活性及功能等方面的改善。本实验室前期工作中也证实创伤应激后,脾脏淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性及IL-2的产生明显下降,术后单次电针对以上免疫抑制状态有明显的改善作用。在临床上针灸的保健作用已得到证实,长期规律施以针刺对于中老年人具有免疫调节作用。我们采用术后单次电针或术前多次电针结合术后单次电针这两种不同治疗方式,因此,本研究比较了电针免疫调节的年龄相关差异性,并探讨电针调节免疫功能的机制。Src蛋白激酶属于非受体酪氨酸蛋白激酶家族,主要包括8种高度同源的蛋白c-Src、Fyn、Yes、Lck、Lyn、Hck、Fgr和Blk,是胞内重要的信号分子之,主要通过调节蛋白酪氨酸磷酸化,参与调节细胞增殖、分化、迁移和细胞形态的维持,同时也参与T细胞受体的激活。因此,在外周免疫系统及细胞活动中发挥重要的作用。c-Src、Fyn、Yes在中枢神经系统大量表达。在卜丘脑部位Fyn相关蛋白的激活能影响大鼠摄食及能量代谢。在海马部位,Fyn参与突触的可塑性,与海马结构的完整性密切相关,在学习记忆过程中发挥重要作用。Fyn还参与到大脑皮层构建,并且与衰老相关神经元回路的重塑密切相关。提示Fyn在应激相关脑区均发挥重要作用并且与衰老相关。ERK1/2是Src蛋白激酶信号通路的主要组成部分之一,Fyn能通过G蛋白偶联受体以及生长因子受体激活下游ERK1/2,因此Fyn—RK1/2作为信号转导交互激活的重合点参与到多条信号转导途径。Src蛋白激酶家族及其下游ERKl/2信号转导通路也被证明参与神经免疫调节,能够改善由于应激或吗啡依赖、戒断导致的免疫抑制。因此Fyn-ERK1/2信号通路是本论文关注的重点,着力探讨这一通路在神经免疫调节及电针调节中的作用。Src家族激酶可被上游许多信号分子激活,包括NMDA受体、生长因子受体、G蛋白偶联受体和钙离子等。TrkB是神经营养因子受体的一种,目前已知它的特异性配体包括脑源性神经营养因子BDNF和NT4/5。Fyn对各类生长因子受体的磷酸化作用已被证实,它同样参与不同条件下TrkB的激活：在BDNF存在的情况下Fyn能易化BDNF诱导的TrKB激活；在G蛋白偶联受体的介导下,Fyn能在神经营养因子BDNF缺失的条件下激活TrKB；而在Zn2+激活TrkB的过程中,Src和Fyn的参与是必要条件。BDNF或Zn2+均能首先使TrkB的Tyr-705/06位点磷酸化而Fyn则进一步参与到TrkBTyr-515位点的磷酸化过程中。可见,Fyn既能协同G蛋白偶联受体或Zn2+作为上游信号激活TrkB,亦可在TrkB激活的状态下作为下游分子进一步放大激活信号。不同形式的TrkB激活均能调节下丘脑CRH的表达,这使Fyn能通过介导TrkB的激活参与到HPA轴的调控中。Fyn作为一个具有丰富上下游的信号分子,其复杂的可调控性使其更有可能承接针刺调节的复杂节点。本课题试图从中枢神经系统中可能介导了神经保护的信号分子Fyn入手,并通过对其上下游信号分子的探讨,观察它在应激免疫调节中的作用,并进一步探讨电针对创伤应激介导免疫反应的调节机制。综上所述,本研究拟在不同年龄段大鼠创伤应激模型上：(1)通过淋巴细胞转化功能的检测及自然杀伤(NK)细胞活性检测观察创伤应激对不同年龄段大鼠免疫功能的影响,并评估单次或多次电针治疗对不同年龄段创伤应激大鼠免疫功能的调节作用,观察不同年龄段大鼠电针疗效的差异性；(2)针对应激相关的脑区即前额皮层、海马、下丘脑部位,通过免疫组织化学、蛋白免疫印迹等分子生物学方法观察大鼠创伤应激后脑内Fyn/NeuN共表达细胞的变化及下游pERK1/2的变化,并观察电针调节过程中出现的改变；(3)调控脑内Fyn或下游pERK1/2的表达,观察创伤应激大鼠免疫功能的变化,明确Fyn及下游pERK1/2的免疫调节作用；(4)针对应激相关的脑区即前额皮层、海马、下丘脑部位,通过免疫组织化学、蛋白免疫印迹等分子生物学方法观察大鼠创伤应激后Fyn/TrkB共表达细胞,BDNF的表达变化,以及不同磷酸化位点TrkB的表达变化,并观察电针调节过程中出现的改变；通过体外实验,在原代培养的神经元中观察酪氨酸蛋白激酶抑制剂PP2对BDNF诱导不同磷酸化位点TrkB的表达影响,进一步探讨Fyn对TrkB的调节机制。实验结果如下：1.创伤应激对不同年龄段大鼠免疫功能的影响以及电针的调节作用1月龄与12月龄大鼠各自随机分为：对照组(无创伤应激组TO),创伤应激1天组(T1),创伤应激3天组(T3),创伤应激7天组(T7)。淋巴细胞转化功能的检测及自然杀伤(NK)细胞活性检测的结果表明,不同年龄段的大鼠在给予创伤应激造模后,淋巴细胞转化功能以及NK细胞活性均明显下降。免疫活性在创伤后1天达到最低,3天时可以观察到恢复的趋势,到了创伤后第7天基本恢复正常。两个年龄段大鼠相比,12月龄的大鼠免疫抑制程度低、持续时间延长,且7天后未见完全恢复,与正常水平相比仍有统计学差异。1月龄与12月龄大鼠各自随机分为：对照组(无创伤应激组T0),创伤应激1天组(T1),创伤应激+单次电针治疗组(T1+SEA),创伤应激+多次电针治疗组(T1+MEA),创伤应激+单次假电针组(T1+shamSEA),创伤应激+多次假电针组(T1+shamMEA)。其中,单次电针为术后即刻给予一次电针,多次电针为术前14次隔日电针结合术后即刻电针。淋巴细胞转化功能的检测及自然杀伤(NK)细胞活性检测的结果表明,单次或多次电针治疗对不同年龄段创伤应激大鼠免疫功能的调节作用具有差异性。不同年龄段大鼠通过单次电针治疗后免疫活性均有不同程度的改善,1月龄大鼠在给予单次电针治疗后,淋巴细胞转化功能及自然杀伤(NK)细胞活性的提高较对照组有明显统计学差异,相比较而言12月龄大鼠在单次电针治疗后免疫活性有所恢复但并未达到统计学差异。然而,术前多次电针加术后单次电针能明显促进12月龄大鼠创伤应激后免疫抑制的恢复。但多次电针相较单次电针,对于1月龄大鼠并未起到更好的调节作用。而单次或多次假电针均未起到明显的免疫调节作用。2.不同年龄段大鼠创伤应激后脑内Fyn/NeuN共表达细胞及下游ERK1/2的变化并观察电针调节过程中出现的改变实验分组同1,在前额皮层、海马CA3/DG区、下丘脑室旁核(PVN),通过免疫荧光双标,我们观察到脑内Fyn/NeuN共表达的细胞在免疫抑制的恢复过程中呈现增加的趋势,及创伤应激1天后Fyn/NeuN共表达的细胞开始增加,3天后Fyn/NeuN共表达的细胞数量到达最大值,7天后共表达的细胞数量基本恢复到创伤应激前的水平。Fyn/NeuN的共表达趋势在不同年龄段大鼠中是有差距的,在整个创伤应激恢复阶段,12月龄大鼠共表达细胞数量较1月龄的大鼠少,创伤应激7天后12月龄大鼠Fyn/NeuN共表达细胞尚未恢复到创伤应激前的水平,较对照组仍有较高水平的表达。创伤应激后不同年龄段大鼠前额皮质的p-ERK1/2的表达均有不同程度的升高。创伤应激1天后p-ERK1/2的表达开始增加,3天后p-ERK1/2的表达到达峰值。与月龄1月大鼠相比较月龄12月大鼠在创伤应激恢复过程中p-ERK1/2的表达整体减少。创伤应激后p-ERK1/2的变化趋势与Fyn在创伤后的表达一致。但7天后p-ERK1/2的表达在各年龄段大鼠中均未恢复到创伤应激前水平。电针治疗后在前额皮层、海马CA3/DG区、下丘脑室旁核(PVN),通过免疫荧光双标,我们观察到单次电针能不同程度的提高不同年龄段大鼠Fyn/NeuN共表达的阳性细胞数量。在单次电针治疗后1月龄大鼠较12月龄大鼠Fyn/NeuN共表达的细胞增加更为显著。然而,多次电针较单次电针治疗能够显著提高12月龄大鼠Fyn/NeuN共表达的细胞数量,但多次电针较单次电针相比并未能在1月龄大鼠上进一步提高Fyn/NeuN共表达细胞数。而单次或多次假电针均不能明显的提高Fyn/NeuN共表达阳性细胞数量。电针同样能提高Fyn下游pERK1/2的表达,pERKl/2表达量的变化与Fyn的表达变化一致。3.中枢调控Fyn及ERK1/2参与到创伤应激诱导免疫抑制的恢复两个年龄段大鼠各自随机分为：对照组(无创伤应激组TO),创伤应激3天组(T3),创伤应激3天+FynAntibody(T3+FynAb),创伤应激3天+activeFyn(T3+activeFyn),创伤应激3天+PD98059(T3+PD98059),创伤应激3天+U0126(T3+U0126),创伤应激3天+PD98059&activeFyn(T3+PD98059&activeFyn)。以Fyn为调控点,在Fyn表达最量最多的创伤应激后第三天为时间节点,在不同年龄段创伤应激大鼠通过侧脑室给予有活性的FyncDNA腺病毒以及Fyn抗体,我们观察到,上调脑内Fyn的表达不同年龄段大鼠的淋巴细胞的转化功能及自然杀伤细胞活性均有提高。相反的,下调脑内Fyn的表达,不同年龄段大鼠的淋巴细胞的转化功能及NK细胞活性均下降。通过进一步实验在上调脑内Fyn表达的同时通过给予Fyn下游信号通路ERK1/2的抑制剂,Fyn提高免疫活性的趋势受到一定程度抑制。在单独给予ERK1/2抑制剂时,不同年龄段大鼠的免疫活性也受到抑制。4.大鼠创伤应激后Fyn/TrkB共表达细胞数量、BDNF的表达变化、以及不同磷酸化位点TrkB的表达变化以及电针调节过程中出现的改变实验分组同1,在前额皮层、海马CA3/DG区、下丘脑室旁核(PVN),通过免疫荧光双标,我们观察到创伤应激后不同年龄段大鼠脑内Fyn/TrkB共表达的细胞在免疫抑制的恢复过程中呈现增加的趋势,及创伤应激1天后Fyn/TrkB共表达的细胞开始增加,3天后Fyn/TrkB共表达的细胞数量到达峰值,7天后共表达的细胞数量基本恢复到创伤应激前的水平。Fyn/TrkB的共表达趋势在不同年龄段大鼠中是有差距的,在整个创伤应激恢复阶段,月龄12月龄大鼠共表达细胞数量较1月龄的大鼠少,创伤应激7天后12月龄大鼠Fyn/TrkB共表达细胞尚未恢复到创伤应激前的水平,较对照组仍有较高水平的表达。Fyn/TrkB共表达的细胞数量变化趋势与Fyn/NeuN共表达的细胞一致。且与Fyn共标的TrkB阳性细胞的形态发生了变化,荧光信号出现了集中和增强。电针治疗后在前额皮层、海马CA3/DG区、下丘脑室旁核(PVN),通过免疫荧光双标,我们观察到单次电针能不同程度的提高不同年龄段大鼠Fyn/TrkB共表达的阳性细胞数量。在单次电针治疗后1月龄大鼠较12月龄大鼠Fyn/TrkB共表达的细胞增加更为显著。然而,多次电针较单次电针治疗能够显著提高12月龄大鼠Fyn/TrkB共表达的细胞数量,但多次电针较单次电针相比并未能在1月龄大鼠上进一步明显提高Fyn/TrkB共表达细胞数。而单次或多次假电针均不能明显的提高Fyn/TrkB共表达阳性细胞数量。下丘脑p-TrkB(Tyr-705/706)和p-TrkB(Tyr-515)在创伤应激后均有不同程度的升高,创伤应激后第三天到达峰值,1月龄大鼠组p-TrkB(Tyr-515)在创伤应激后第7天基本恢复正常水平,但p-TrkB(Tyr-705/706)表达较对照组仍略有提高。12月龄大鼠组的p-TrkB(Tyr-705/706)和p-TrkB(Tyr-515)表达水平在创伤应激后第7天均未恢复至对照组水平。单次电针或多次电针均能引起创伤应激后不同年龄段大鼠下丘脑p-TrkB(Tyr-705/706)和p-TrkB(Tyr-515)表达增多。多次电针较单次电针在12月龄大鼠上更显著的提高了p-TrkB(Tyr-515)的表达。免疫组织化学DAB染色发现创伤应激后皮层、海马、下丘脑BDNF阳性细胞出现空泡现象,而BDNF蛋白免疫印迹结果表示BDNF蛋白量并未出现明显变化。提示创伤应激后Fyn/TrkB激活可能存在其他机制。5.Src激酶抑制剂PP2在原代培养神经元中对TrkB磷酸化的作用胎鼠皮层神经元原代培养后分为三组：对照组,BDNF给药组,PP2+BDNF给药组。通过蛋白免疫印迹实验,我们发现BDNF能显著诱导TrkBTyr-705/706及Tyr-515位点的磷酸化,提前1hPP2预处理能部分逆转BDNF诱导的TrkBTyr-705/706位点的磷酸化,并能完全抑制TrkBTyr-515位点的磷酸化。综上所述,本论文获得以下结论：1.创伤应激能诱导不同年龄段大鼠的免疫抑制,12月龄大鼠较1月龄大鼠免疫抑制更为明显,且恢复时程延长。不同的电针给予方式针对不同年龄段大鼠其调节作用具有年龄相关的差异性。2.Fyn及下游的pERK1/2参与到创伤应激大鼠免疫抑制的恢复过程中,并且与电针的调节效应相关。神经元可能是创伤应激及电针免疫调节过程中的重要细胞类型。3.创伤应激后TrkB在不同年龄段表达具有差异性,且与免疫活性恢复程度相关,与Fyn相关联的TrkB的激活可能参与到免疫应激的恢复过程中。4.电针调节能诱导不同位点TrkB磷酸化,且电针对TrkBTyr-515位点的调节作用更强,提示Fyn可能作为电针调节效应的靶点之一。
【作者】肖晟；
【导师】吴根诚；
【作者基本信息】复旦大学，中西医结合基础，2012，博士
【关键词】创伤；应激；电针；免疫抑制；淋巴细胞；自然杀伤细胞；酪氨酸蛋白激酶；细胞外信号调节激酶1/2；酪氨酸激酶受体B；

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